流程

1：抗体验证

2：蛋白+抗体+磁珠孵育

3：RNA纯化

4：QPCR检测/高通量测序

1.1细胞裂解液的获取

1、将细胞培养至状态良好，吸除培养基，加5ml PBS，左右晃动，清洗细胞一次

2、加入1ml 胰酶消化，消化完全后，加2ml完全培养基终止消化。

3、1200rpm，离心1min，去上清。

4、每1x107个细胞加入500l的RIPA裂解液。

5、每ml RIPA裂解液加10l的PMSF以及磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，翻转裂解2h，12000rpm离心15min，取上清，-20℃保存。

1.2 Western检测目的蛋白

1、先配置10%的分离胶，加乙醇静置20min，待分离胶凝固，吸除乙醇，再用水冲洗残余的乙醇，吸水纸吸去残液。加入配置好的5%的浓缩胶，插入梳子，静置20min，待浓缩胶凝固后拔出梳子。

2、安装好电泳装置，上样，先70V,15min，后120V，90min。

3、转膜，湿转120V稳压转100min。

4、封闭，将PVDF膜放入5%的脱脂牛奶中，封闭30min。

5、TBST洗膜3次，每次5min。

6、孵育一抗（TBST稀释），4℃孵育过夜。

7、TBST洗膜3次，每次10min。

8、孵育二抗（TBST稀释），室温孵育1h。

9、TBST洗膜3次，每次10min。

10、按1：1的比例加入试剂盒中的两种发光剂，孵育1min。

11、显影、定影，扫描结果。

1.3磁珠与抗体结合

1、标记实验所需的1.5ml EP管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照。

2、吸取50l重悬后的磁珠悬液于每个1.5ml EP。

3、每管加入500l RIP Wash Buffer，涡旋震荡。

4、将1.5ml EP管置于磁力架上，待溶液澄清去上清，重复一次。

5、用500l的RIP Wash buffer重悬磁珠，加入5g 相应抗体于每个样品中，4℃孵育4h。

6、将1.5ml EP管置于磁力架上，弃上清。

7、加入500l RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次。

8、加入RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上。

1.4磁珠抗体复合物与蛋白结合

1、将上一步的EP管放磁力架上，去上清，每管加入900l的RIP Immunoprecipitation Buffer。

2、迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，12000rpm，4℃离心10min。吸取100l上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml。4℃孵育过夜。

3、孵育完后，短暂离心，将EP管放磁力架上，待溶液澄清去上清，加入500l RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将EP管放磁力架上，去上清，重复5次，总共清洗6次。

1.5 RNA洗脱

1、用150l的Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物，55℃孵育30min。

2、孵育完后，将EP管放磁力架上，将上清吸入一新的1.5ml EP管中，于每管中加入250l RIP Wash Buffer。

3、再加入400l苯酚：氯仿：异戊醇（125：24：1）涡旋震荡15s，室温下12000rpm离心10min。

4、小心吸取上层水相，吸入另一新的1.5ml EP管中，于每管中加入400l氯仿，涡旋震荡15s，室温下12000rpm离心10min。

5、小心吸取上层水相，吸入另一新的1.5ml EP管中，每管加入850l无水乙醇（无RNase），混匀，-20℃沉淀过夜。

6、孵育完后，12000rpm，4℃离心15min，小心去上清。

7、加入900l 80%的乙醇，12000rpm，4℃离心15min，小心去上清，打开盖，静置3min，晾干。

8、加入10l DEPC水溶解，-80℃保存。

1.6将RNA反转录成cDNA

1、配制如下表所示的反应体系。

RNA变性反应体系

2、将上述体系混匀，短暂离心，25℃温育5min。42℃温育60min，70℃孵育5min，终止反应。

3、qPCR检测。

4、q-pcr数据处理